Антивирусная активность Гамапрена в отношении вируса диареи крупного рогатого скота в экспериментах in vitro

³Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина»  (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23)

К числу флавивирусных инфекций, наиболее значимых в ветеринарной практике, относят вирусную диарею крупного рогатого скота (ВД КРС), возбудителем которой является  РНК-содержащий вирус из рода Pestivirus, семейства Flaviviridae. Актуальной задачей для лечения и профилактики данного заболевания остается поиск надежных, эффективных и безопасных препаратов с противовирусной  активностью.

Одним из перспективных иммуномодулирующих препаратов, обладающих противовирусной активностью в отношении различных флавивирусов, является Гамапрен (ГП) – полипренилфосфат натрия, полученный из листьев шелковицы.

Целью настоящей работы было: изучить влияние ГП на репродукцию вируса диареи крупного рогатого скота (ВД КРС) и динамику накопления вирусных белков в культуре клеток коронарных сосудов теленка (КСТ).

Для выявления противовирусной активности ГП в опытах in vitro ВД КРС титровали в присутствии ГП, который добавляли в каждое разведение вируса в дозе 200 мкг/мл, оценивая рeзультаты титрования в Lg ЦПД_50. Влияние ГП на динамику накопления вирусных белков оценивали в реакции преципитации.

Установлено, что ГП  подавляет    размножение  ВД КРС в культуре клеток на 1,8 lg. При этом наблюдали замедление проявления цитопатического действия вируса на 24-48 часов по сравнению с контролем. Данные, полученные с помощью реакции преципитации, свидетельствуют о значительном подавлении накопления белков ВД КРС в культуре клеток КСТ в присутствии ГП на ранних сроках (2-6 часов после инфицирования).

Таким образом, под действием ГП изменяются сроки созревания белков ВД КРС в клетках, что может объяснять наблюдаемое снижение инфекционности вируса при воздействии ГП.

Ключевые слова: вирус диареи крупного рогатого скота, флавивирусы, гамапрен, полипренилфосфат, противовирусная активность, иммуномодулятор

Antiviral activity of Gamapren against the bovine diarrhea virus  in the in vitro experiments Sanin A.V., Ozherelkov S.V., Narovljanskij A.N., Pronin A.V, Deeva A.V, Kozhevnikova T.N., Zubashev I.K., Agafonova A.D.,  Izmest'eva A.V ., Belousova R.V.

Bovine diarrhea virus (BDV), belonging to Flaviviridae family, is the causative agent of highly infectious disease of the cattle. That is why search for reliable, effective and safe antiviral drugs able to treat and prevent this disease is very important.

One of the promising immunomodulatory drugs with antiviral activity is Gamapren (GP) – phosphorylated polyprenol obtained from mulberry leaves.

The aim of this work was to study the effect of GP on reproduction of BDV and the dynamics of viral proteins accumulation  in cell culture of the calf coronary vessels.

To assess the antiviral activity of GP in the in vitro experiments BDV was titrated in the presence of GP, which was added to each dilution of the virus at a dose of 200 µg/ml, evaluating the results of the titration by lg CPA₅₀. The influence of GP on the dynamics of the viral proteins accumulation  was evaluated in the precipitation reaction.

GP was found to inhibit the BDV reproduction by 1.8 lg. Also observed was the delay in the manifestation of the BDV cytopathic action for 24-48 hours compared to control. The data obtained in the precipitation assay indicate a significant suppression of the accumulation of BDV proteins  in the cell culture in the presence of GP at the early stages (2-6 hours after infection).

Thus, GP influences the time of BDV proteins  maturation in the cel culture, which may explain the observed loss of  BDV infectivity following  exposure to GP.

Key words: bovine virus diarrhea, flavivirus, gamapren, polyprenylphosphatis, antiviral activity,

Сокращения: вирус диареи крупного рогатого скота (ВД КРС), Гамапрен (ГП), культура клеток коронарных сосудов теленка (КСТ), метод радиоиммунопреципитации (РИП)

Введение

К числу флавивирусных инфекций, наиболее значимых в ветеринарной практике, относят вирусную диарею крупного рогатого скота (ВД КРС), возбудителем которой является  РНК-содержащий вирус из рода Pestivirus, семейства Flaviviridae. Актуальной задачей для лечения и профилактики данного заболевания остается поиск надежных, эффективных и безопасных препаратов с противовирусной  активностью [2,3].

Несмотря на интенсивный скрининг, проводимый во всём мире, количество противовирусных препаратов при ряде инфекций ограничено, вплоть до полного их отсутствия при некоторых инфекционных заболеваниях. В значительной степени это объясняется особенностью паразитизма вирусов, поражающих геном клетки. С этим связано важное требование к поиску противовирусных препаратов, которые должны либо непосредственно воздействовать на сам вирус, не повреждая клетки, в которых он паразитирует, либо обладать способностью активировать выработку эндогенного интерферона. Важнейшим свойством таких препаратов должна быть также способность повышать естественную резистентность организма и стимулировать противовирусный иммунный ответ. Одним из перспективных иммуномодулирующих препаратов, обладающих противовирусной активностью в отношении различных флавивирусов, является Гамапрен (ГП) – полипренилфосфат натрия, полученный из листьев шелковицы. Ранее было показано, что препараты на основе фосфорилированных полипренолов обладают противовирусной активностью по отношению к другим флавивирусам:  вирусу клещевого энцефалита, вирусу желтой лихорадки и вирусу гепатита С [1,4,7,9].

Целью настоящей работы было: изучить влияние ГП на репродукцию вируса диареи крупного рогатого скота (ВД КРС) и динамику накопления вирусных белков в культуре клеток коронарных сосудов теленка (КСТ).

Материалы и методы

Вирус. В работе использовали ВД КРС (штамм ТЛ), полученный на кафедре ветеринарной вирусологии биологического факультета МГАВМ и Б им. К.И.Скрябина.

Культура клеток. В качестве субстрата для размножения ВД КРС использовали перевиваемую культуру КСТ, полученную на кафедре ветеринарной вирусологии биологического факультета МГАВМ и Б им. К.И.Скрябина.

Препараты. В работе использовали коммерческий препарат ГП производства ООО «Гамаветфарм».

Сыворотка. В опытах использовали поликлональную сыворотку кролика против ВД КРС, полученную на кафедре ветеринарной вирусологии Биологического факультета МГАВМ и Б им. К.И.Скрябина.

Выявление противовирусной активности ГП в опытах in vitro.

ВД КРС титровали в присутствии ГП, который добавляли в каждое разведение вируса в дозе 200 мкг/мл, препарат до нужной концентрации разводили поддерживающей средой Игла МЕМ.

В качестве контроля использовали раствор плацебо (не содержащий полипренилфосфатов комплексный водный растворитель), разведённый поддерживающей средой 1 : 20).

В каждом опыте проводили контроль на токсичность ГП: с этой целью в культуру клеток вносили препарат в дозах 100 - 200 мкг/мл.

После заражения контрольные и экспериментальные пробирки с клетками помещали в термостат и содержали при + 37° С в течение  5-и суток, проводя ежедневные визуальные наблюдения за состоянием культур клеток.

Рeзультаты титрования оценивали в Lg ЦПД_50.  Опыты повторяли троекратно.

Реакция радиоиммунопреципитации (РИП). Четырехдневную культуру клеток КСТ вносили в стандартные культуральные флаконы (S=25см²) и после образования полного монослоя заражали ВД КРС с множественностью заражения 5–10 БОЕ/кл. Схема заражения представлена в Таблице 1.

Таблица 1.Схема заражения клеток КСТ вирусом ВД КРС в присутствии ГП (400 мкг/мл)

После двухчасовой адсорбции при +37°С во флаконы вносили по 2 мл среды для мечения. Состав среды для мечения на 6 проб: Раствор Эрла — 25,2 мл (+ ГП, 400 мкг/мл); [¹⁴С]–меченный белковый гидролизат — 210 мкл; форсколин 10 мМ — 20 мкл. Через два часа после начала мечения во флаконы 1–3, 4, 9 добавили по 0.5 мл РИП–буфера (Трис–HCl 10 мМ рН 8.0, NaCl 0.15 М, ЭДТА 1 мМ, NP–40 1 %, апротинин 1:1000) и поместили в холодильную камеру (при –70°С).  После начала мечения пробы обрабатывали РИП–буфером и полученные образцы вносили во флаконы через 2 часа (табл.1,пробы №№ 3, 8); через 4 часа  (табл.1,пробы №№4, 9); через 6 часов (табл.1, пробы №№ 5, 10); через 8 часов (табл. 1, пробы №№ 6, 11; через 24 часа (табл. 1 , пробы №№ 7, 12). При постановке реакции все флаконы с пробами были трижды подвергнуты замораживанию и оттаиванию. Полученный экстракт вносили в микроцентрифужные пробирки и центрифугировали в течение 20 мин при 14 тыс. об/мин. Из супернатанта в пробирки отобрали аликвоты по 180 мкл и добавляли к ним по 10 мкл поликлональной сыворотки к ВД КРС. Реакционную смесь помещали на 12 часов в холодильник (+4°С).  ПротеинА–сефарозу смешивали в РИП–буфере в соотношении 1:1 и через 24 часа трехкратно промывали равным объемом РИП–буфера. Осадок ресуспендировали в равном объеме РИП–буфера и добавляли по 50 мкл суспензии во все пробы. Образцы инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре, встряхивая каждые 20 минут. По окончании инкубации пробы центрифугировали в течение 10 мин при 6 тыс. об/мин, затем промывали пятикратно в  1 мл W–буфера (Трис–HCl 10 мМ рН 8.0, NaCl 0.15 М, ЭДТА 1 мМ, NP–40 0.01 %). К пробам после обработки буфером добавляли по 50 мкл S–буфера для нанесения на гель (Трис–HCl 0.0625 М рН 6.8, глицерин 20 %, b–меркаптоэтанол 10 %, додецилсульфат натрия (Дс–Na) 2 %, бромфеноловый синий на кончике шпателя) и выдерживали при  +4°С в течение 24 часов. Через 24 часа проводили гель–электрофорез в денатурирующих условиях (1 % Дс–Na) по Лэммли в 10 % полиакриламидном геле. Разделение заканчивали в момент выхода из геля краски (бромфенолового синего). Гели фиксировали в течение 1 часа в водном растворе, содержащем 10 % этанола 96 %, 20 % ледяной уксусной кислоты. Фиксированные гели отмывали водой до исчезновения запаха уксусной кислоты (1 час), трехкратно обрабатывали безводным диметилсульфоксидом по 20 мин и инкубировали в течение 1 часа при 20°С в 20 %–ном растворе сцинтиллятора (PPO) в диметилсульфоксиде. По окончании обработки гели сушили в вакуумной сушке при температуре +80°С в течение 30 мин. Далее сухие пластины помещали в рентгенографическую кассету с пленкой Kodak на 30 суток в холодильную камеру (при –70°С).

Результаты исследований

Результаты, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что ГП  подавляет    размножение  ВД КРС в культуре клеток КСТ. При этом во всех пробирках с клетками, в которые вносили вирус и ГП, наблюдали замедление проявления цитопатического действия вируса на 24-48 часов по сравнению с клетками, зараженными ВД без препарата. Обработка вируса и клеток раствором плацебо не приводила к каким-либо достоверным изменениям в титре вируса (пробы 1-я и 2-я) и не отражалась на сроках проявления ЦПД в заражённой культуре клеток. Соответствующие контроли показали полное отсутствие токсичности исследованной дозы ГП для клеток КСТ.

Таблица 2. Влияние ГП на репродукцию ВД КРС

Примечание: * разница между соответствующими показателями для проб 1 и 3; 2 и 3  статистически достоверна при Р< 0,05

        На радиоавтографе (рисунок) приведены результаты анализа проб лизированных клеток, исследованных через 2, 4, 6, 8 и 24 часа после начала инфекции с поликлональной сывороткой кролика против ВД КРС.

Рисунок. Динамика накопления вирусных белков в присутствии ГП

Дорожка 3, соответствующая  2 часам инкубации культуры с вирусом без добавления препаратов, показывает максимальное накопление вирусных белков; через 4 и 6 часов вирусные белки выявляются слабее, через 8 и 24 часа вирусные белки практически не выявляются. Дорожка 8 соответствует 2 часам инкубации культуры с вирусом, в присутствии ГП. Интенсивность этих полос значительно отличается от контрольной 3 дорожки. Дорожки 9,10, соответствующие 4 и 6 часам инкубации культуры с вирусом в присутствии ГП, также отражают значительное подавление  накопления вирусных белков.

Таким образом, представленные на рисунке данные свидетельствуют о значительном подавлении накопления белков ВД КРС в культуре клеток КСТ в присутствии ГП на ранних сроках (2-6 часов после инфицирования).

Ежедневное визуальное наблюдение в световом инвертированном микроскопе за клетками, зараженными ВД КРС в присутствии ГП и контрольной культурой, инфицированной вирусом без ГП, показало, что ГП задерживает развитие характерного для ВД КРС цитопатического действия на 24-48 часов по сравнению с контролем.

Обсуждение

Препараты, действующим веществом которых служат фосфорилированные полипренолы – Фоспренил (содержит полипренолы, выделенные из хвои сибирской пихты) и ГП (содержит полипренолы, выделенные из листьев шелковицы) – исключительно активные в фармакологическом плане соединения. Они обладают не только иммуномодулирующими [1,7,12] и противовирусными [1], но также противовоспалительными [14], адъювантными [5,10] и иными важными свойствами. Противовирусную активность данные препараты проявляют по отношению  к ДНК- и РНК-геномным вирусам, как имеющим оболочку, так и лишенным ее [6,8,11,13].

В представленной работе установлено, что ГП  в дозе 200 мкг обладает способностью значительно (на 1,8 lg) подавлять размножение ВД КРС в культуре КСТ. В то же время механизмы противовирусного действия ГП на этапах взаимодействия вирус-клетка остаются недостаточно изученными. Результаты, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о способности ГП изменять сроки созревания вирусных белков высокоактуального для  ветеринарной медицины ВД КРС в клетках, что может объяснять наблюдаемое снижение инфекционности вируса при воздействии препарата. Не исключено, что одним из механизмов влияния ГП на накопление вирусных частиц является стимуляция продукции клеточного интерферона, что показано в отношении Фоспренила [1,4]. Кроме того, препараты на основе полипренилфосфатов влияют на адсорбцию и проникновение определенных вирусов путем блокирования гликопротеиновых рецепторов, а также, возможно - модификации клеточных мембран. Взаимодействуя с вирионами вне клетки, они препятствуют заражению клеток-мишеней. Вдобавок, с помощью электронной микроскопии установлено, что после воздействия данных препаратов среди выходящих из клетки вирусных частиц попадается много дефектных и интерферирующих (препятствующих репликации других вирусов) вирионов, утративших способность заражать другие клетки-мишени [1,6,12]. Вполне возможно также, что фосфорилированные полипренолы препятствуют пренилированию и гликозилированию вирусных белков в клетках, что служит предметом дальнейших исследований.  

Литература

1. Васильев А.Н. Противовирусная и иммуномодулирующая активность полипренилфосфатов  при  вирусных инфекциях / Васильев А.Н., Ожерелков С.В., Козлов В.В., Пронин А.В., Санин А.В., Парфёнова Т.М., Изместьева А.В.,. Амченкова А.М, Кожевникова Т.Н., Степанова Т.Н., Наровлянский А.Н // Антибиотики и химиотерапия. ― 2008. ― Т. 53. ― №3-4. ― С. 3–8.
2. Глотова Т.И., Противовирусная активность нового химического соединения./ Глотова Т.И., Сильников В.Н., Королева Л.С., Кунгурцева О.В., Тихонов В.Л., Глотов А.Г.//  РВЖ СХЖ― 2012― №1 ―с. 22-24
3. Глотова Т.И. Инфекционный ринотрахеит и вирусная диарея крупного рогатого скота: диагностика, молекулярно-биологические свойства возбудителей, эффективность противовирусных препаратов.// Автореф.дисс.докт.биол.наук ― 2006 Новосибирск― С. 48
4. Годунов Р.С. Иммуномодулирующая и противовирусная активность полипренолов природного происхождения.// Автореф. дисс.канд.мед.наук.   Москва ―  2006― С.24
5. Кожевникова Т.Н. Использование фоспренила в качестве адъюванта для вакцин и стимулятора продукции специфических антител при изготовлении гипериммунных сывороток/ Кожевникова Т.Н., Ворович М.Ф., Козлов В.Г.,Ожерелков С.В., Наровлянский А.Н. , Пронин А.В., Санин А.В.// Росс.ветеринарный журнал МДЖ―  2006 №2―  С.8-10
6. Кожевникова Т.Н. Морапренилфосфаты подавляют размножение вируса энцефаломиелита Тейлера и накопление вирусного белка VP3 в чувствительных культурах клеток BHK-21 и P388D1. / Кожевникова Т.Н.,Викторова Е.Г., Козлов В.Г., Наровлянский А.Н., Санин А.В., Пронин А.В., Ожерелков С.В.// Ж..микробиол. ― 2007.― №3.― С. 26-30.
7. Наровлянский А.Н., Противовирусная активность полипренилфосфатов при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом гепатита С in vitro./ Наровлянский А.Н., Дерябин П.Г., Седов А.М., Санин А.В., Пронин А.В. // Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии ― 2012.―№5. ―  С.80-84.
8. Ожерелков С.В Защитное действие нового противовирусного препарата Фоспренил при экспериментальном клещевом энцефалите/ Ожерелков С.В.,Тимофеев А.В., Новикова Г.П., Деева А.В., Наровлянский А.Н., Санин А.В., Пронин А.В.. // Вопр. Вирусол. ―2000. ―Т.45. ―№ 1. ―С.33-37.
9. Ожерелков С.В. Противовирусное действие препаратов  Фоспренил и Гамапрен  в отношении флавивирусов./ Ожерелков С.В. Кожевникова Т.Н., Наровлянский А.Н., Пронин А.В., Санин А.В. // Ветеринария и кормление. ―2017. ― №3 ―С.78-80
10. Пронин А.В., Ожерелков С.В., Деева А.В., Санин А.В., Наровлянский А.Н. Полипренилфосфаты как адъюванты, поляризующие иммунный ответ в сторону Th1. Инфекция и иммунитет. ―2012. ― Т.2 ―№3. ― С.645-50

11.  Русских В.В. Ринотрахеит кошек : клинико-эпизоотологические аспекты, противовирусная активность препаратов/ Русских В.В. //Диссертация ... кандидата ветеринарных наук ―2009―Новосибирск [Место защиты: Ин-т эксперим. ветеринар. Сибири и Дал. Востока] ― С.131

12.  Санин А.В. Применение иммуномодуляторов при вирусных заболеваниях мелких домашних животных.// Российский ветеринарный журнал. МДЖ. ― 2005. ― №1.― С.38-42

13.  Санин А.В. Применение Гамапрена при лечении вирусных инфекций у кошек./ Санин А.В.,Савойская С.Л., Васильев И.К., Наровлянский А.Н., Пронин А.В., Е.В.Гордеева.// Ветеринария Кубани― 2009.― №6.― С.29-30

14.  Санин А.В. Фосфорилированные полипренолы – новый класс соединений с противовоспалительной и бронхолитической активностью./ Санин А.В., Ганшина И.В., Судьина Г.Ф., Санина В.Ю., Кожевникова Т.Н., Пронин А.В., Наровлянский А.Н., Суханова С.А., Проскурина О.В., Митрохин Н.М. // Инфекция и иммунитет ― 2011 ―Т.1― №4 ―С.355-360.

А.В. Санин¹, С.В.Ожерелков², А.Н. Наровлянский¹, А.В. Пронин¹,

А.В Деева,¹ И.К.Зубашев¹, Т.Н. Кожевникова¹,

 Анна В.Изместьева¹, А.Д. Агафонова¹, Р.В Белоусова³,

¹Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18).

²Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН(108819,Москва, пос. Московский, посёлок Института полиомиелита, дом. 8, корпус 1) 

³Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина»  (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23)

К числу флавивирусных инфекций, наиболее значимых в ветеринарной практике, относят вирусную диарею крупного рогатого скота (ВД КРС), возбудителем которой является  РНК-содержащий вирус из рода Pestivirus, семейства Flaviviridae. Актуальной задачей для лечения и профилактики данного заболевания остается поиск надежных, эффективных и безопасных препаратов с противовирусной  активностью.

Одним из перспективных иммуномодулирующих препаратов, обладающих противовирусной активностью в отношении различных флавивирусов, является Гамапрен (ГП) – полипренилфосфат натрия, полученный из листьев шелковицы.

Целью настоящей работы было: изучить влияние ГП на репродукцию вируса диареи крупного рогатого скота (ВД КРС) и динамику накопления вирусных белков в культуре клеток коронарных сосудов теленка (КСТ).

Для выявления противовирусной активности ГП в опытах in vitro ВД КРС титровали в присутствии ГП, который добавляли в каждое разведение вируса в дозе 200 мкг/мл, оценивая рeзультаты титрования в Lg ЦПД_50. Влияние ГП на динамику накопления вирусных белков оценивали в реакции преципитации.

Установлено, что ГП  подавляет    размножение  ВД КРС в культуре клеток на 1,8 lg. При этом наблюдали замедление проявления цитопатического действия вируса на 24-48 часов по сравнению с контролем. Данные, полученные с помощью реакции преципитации, свидетельствуют о значительном подавлении накопления белков ВД КРС в культуре клеток КСТ в присутствии ГП на ранних сроках (2-6 часов после инфицирования).

Таким образом, под действием ГП изменяются сроки созревания белков ВД КРС в клетках, что может объяснять наблюдаемое снижение инфекционности вируса при воздействии ГП.

Ключевые слова: вирус диареи крупного рогатого скота, флавивирусы, гамапрен, полипренилфосфат, противовирусная активность, иммуномодулятор

Antiviral activity of Gamapren against the bovine diarrhea virus  in the in vitro experiments Sanin A.V., Ozherelkov S.V., Narovljanskij A.N., Pronin A.V, Deeva A.V, Kozhevnikova T.N., Zubashev I.K., Agafonova A.D.,  Izmest'eva A.V ., Belousova R.V.

Bovine diarrhea virus (BDV), belonging to Flaviviridae family, is the causative agent of highly infectious disease of the cattle. That is why search for reliable, effective and safe antiviral drugs able to treat and prevent this disease is very important.

One of the promising immunomodulatory drugs with antiviral activity is Gamapren (GP) – phosphorylated polyprenol obtained from mulberry leaves.

The aim of this work was to study the effect of GP on reproduction of BDV and the dynamics of viral proteins accumulation  in cell culture of the calf coronary vessels.

To assess the antiviral activity of GP in the in vitro experiments BDV was titrated in the presence of GP, which was added to each dilution of the virus at a dose of 200 µg/ml, evaluating the results of the titration by lg CPA₅₀. The influence of GP on the dynamics of the viral proteins accumulation  was evaluated in the precipitation reaction.

GP was found to inhibit the BDV reproduction by 1.8 lg. Also observed was the delay in the manifestation of the BDV cytopathic action for 24-48 hours compared to control. The data obtained in the precipitation assay indicate a significant suppression of the accumulation of BDV proteins  in the cell culture in the presence of GP at the early stages (2-6 hours after infection).

Thus, GP influences the time of BDV proteins  maturation in the cel culture, which may explain the observed loss of  BDV infectivity following  exposure to GP.

Key words: bovine virus diarrhea, flavivirus, gamapren, polyprenylphosphatis, antiviral activity,

Сокращения: вирус диареи крупного рогатого скота (ВД КРС), Гамапрен (ГП), культура клеток коронарных сосудов теленка (КСТ), метод радиоиммунопреципитации (РИП)

Введение

К числу флавивирусных инфекций, наиболее значимых в ветеринарной практике, относят вирусную диарею крупного рогатого скота (ВД КРС), возбудителем которой является  РНК-содержащий вирус из рода Pestivirus, семейства Flaviviridae. Актуальной задачей для лечения и профилактики данного заболевания остается поиск надежных, эффективных и безопасных препаратов с противовирусной  активностью [2,3].

Несмотря на интенсивный скрининг, проводимый во всём мире, количество противовирусных препаратов при ряде инфекций ограничено, вплоть до полного их отсутствия при некоторых инфекционных заболеваниях. В значительной степени это объясняется особенностью паразитизма вирусов, поражающих геном клетки. С этим связано важное требование к поиску противовирусных препаратов, которые должны либо непосредственно воздействовать на сам вирус, не повреждая клетки, в которых он паразитирует, либо обладать способностью активировать выработку эндогенного интерферона. Важнейшим свойством таких препаратов должна быть также способность повышать естественную резистентность организма и стимулировать противовирусный иммунный ответ. Одним из перспективных иммуномодулирующих препаратов, обладающих противовирусной активностью в отношении различных флавивирусов, является Гамапрен (ГП) – полипренилфосфат натрия, полученный из листьев шелковицы. Ранее было показано, что препараты на основе фосфорилированных полипренолов обладают противовирусной активностью по отношению к другим флавивирусам:  вирусу клещевого энцефалита, вирусу желтой лихорадки и вирусу гепатита С [1,4,7,9].

Целью настоящей работы было: изучить влияние ГП на репродукцию вируса диареи крупного рогатого скота (ВД КРС) и динамику накопления вирусных белков в культуре клеток коронарных сосудов теленка (КСТ).

Материалы и методы

Вирус. В работе использовали ВД КРС (штамм ТЛ), полученный на кафедре ветеринарной вирусологии биологического факультета МГАВМ и Б им. К.И.Скрябина.

Культура клеток. В качестве субстрата для размножения ВД КРС использовали перевиваемую культуру КСТ, полученную на кафедре ветеринарной вирусологии биологического факультета МГАВМ и Б им. К.И.Скрябина.

Препараты. В работе использовали коммерческий препарат ГП производства ООО «Гамаветфарм».

Сыворотка. В опытах использовали поликлональную сыворотку кролика против ВД КРС, полученную на кафедре ветеринарной вирусологии Биологического факультета МГАВМ и Б им. К.И.Скрябина.

Выявление противовирусной активности ГП в опытах in vitro.

ВД КРС титровали в присутствии ГП, который добавляли в каждое разведение вируса в дозе 200 мкг/мл, препарат до нужной концентрации разводили поддерживающей средой Игла МЕМ.

В качестве контроля использовали раствор плацебо (не содержащий полипренилфосфатов комплексный водный растворитель), разведённый поддерживающей средой 1 : 20).

В каждом опыте проводили контроль на токсичность ГП: с этой целью в культуру клеток вносили препарат в дозах 100 - 200 мкг/мл.

После заражения контрольные и экспериментальные пробирки с клетками помещали в термостат и содержали при + 37° С в течение  5-и суток, проводя ежедневные визуальные наблюдения за состоянием культур клеток.

Рeзультаты титрования оценивали в Lg ЦПД_50.  Опыты повторяли троекратно.

Реакция радиоиммунопреципитации (РИП). Четырехдневную культуру клеток КСТ вносили в стандартные культуральные флаконы (S=25см²) и после образования полного монослоя заражали ВД КРС с множественностью заражения 5–10 БОЕ/кл. Схема заражения представлена в Таблице 1.

Таблица 1.Схема заражения клеток КСТ вирусом ВД КРС в присутствии ГП (400 мкг/мл)

После двухчасовой адсорбции при +37°С во флаконы вносили по 2 мл среды для мечения. Состав среды для мечения на 6 проб: Раствор Эрла — 25,2 мл (+ ГП, 400 мкг/мл); [¹⁴С]–меченный белковый гидролизат — 210 мкл; форсколин 10 мМ — 20 мкл. Через два часа после начала мечения во флаконы 1–3, 4, 9 добавили по 0.5 мл РИП–буфера (Трис–HCl 10 мМ рН 8.0, NaCl 0.15 М, ЭДТА 1 мМ, NP–40 1 %, апротинин 1:1000) и поместили в холодильную камеру (при –70°С).  После начала мечения пробы обрабатывали РИП–буфером и полученные образцы вносили во флаконы через 2 часа (табл.1,пробы №№ 3, 8); через 4 часа  (табл.1,пробы №№4, 9); через 6 часов (табл.1, пробы №№ 5, 10); через 8 часов (табл. 1, пробы №№ 6, 11; через 24 часа (табл. 1 , пробы №№ 7, 12). При постановке реакции все флаконы с пробами были трижды подвергнуты замораживанию и оттаиванию. Полученный экстракт вносили в микроцентрифужные пробирки и центрифугировали в течение 20 мин при 14 тыс. об/мин. Из супернатанта в пробирки отобрали аликвоты по 180 мкл и добавляли к ним по 10 мкл поликлональной сыворотки к ВД КРС. Реакционную смесь помещали на 12 часов в холодильник (+4°С).  ПротеинА–сефарозу смешивали в РИП–буфере в соотношении 1:1 и через 24 часа трехкратно промывали равным объемом РИП–буфера. Осадок ресуспендировали в равном объеме РИП–буфера и добавляли по 50 мкл суспензии во все пробы. Образцы инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре, встряхивая каждые 20 минут. По окончании инкубации пробы центрифугировали в течение 10 мин при 6 тыс. об/мин, затем промывали пятикратно в  1 мл W–буфера (Трис–HCl 10 мМ рН 8.0, NaCl 0.15 М, ЭДТА 1 мМ, NP–40 0.01 %). К пробам после обработки буфером добавляли по 50 мкл S–буфера для нанесения на гель (Трис–HCl 0.0625 М рН 6.8, глицерин 20 %, b–меркаптоэтанол 10 %, додецилсульфат натрия (Дс–Na) 2 %, бромфеноловый синий на кончике шпателя) и выдерживали при  +4°С в течение 24 часов. Через 24 часа проводили гель–электрофорез в денатурирующих условиях (1 % Дс–Na) по Лэммли в 10 % полиакриламидном геле. Разделение заканчивали в момент выхода из геля краски (бромфенолового синего). Гели фиксировали в течение 1 часа в водном растворе, содержащем 10 % этанола 96 %, 20 % ледяной уксусной кислоты. Фиксированные гели отмывали водой до исчезновения запаха уксусной кислоты (1 час), трехкратно обрабатывали безводным диметилсульфоксидом по 20 мин и инкубировали в течение 1 часа при 20°С в 20 %–ном растворе сцинтиллятора (PPO) в диметилсульфоксиде. По окончании обработки гели сушили в вакуумной сушке при температуре +80°С в течение 30 мин. Далее сухие пластины помещали в рентгенографическую кассету с пленкой Kodak на 30 суток в холодильную камеру (при –70°С).

Результаты исследований

Результаты, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что ГП  подавляет    размножение  ВД КРС в культуре клеток КСТ. При этом во всех пробирках с клетками, в которые вносили вирус и ГП, наблюдали замедление проявления цитопатического действия вируса на 24-48 часов по сравнению с клетками, зараженными ВД без препарата. Обработка вируса и клеток раствором плацебо не приводила к каким-либо достоверным изменениям в титре вируса (пробы 1-я и 2-я) и не отражалась на сроках проявления ЦПД в заражённой культуре клеток. Соответствующие контроли показали полное отсутствие токсичности исследованной дозы ГП для клеток КСТ.

Таблица 2. Влияние ГП на репродукцию ВД КРС

Примечание: * разница между соответствующими показателями для проб 1 и 3; 2 и 3  статистически достоверна при Р< 0,05

        На радиоавтографе (рисунок) приведены результаты анализа проб лизированных клеток, исследованных через 2, 4, 6, 8 и 24 часа после начала инфекции с поликлональной сывороткой кролика против ВД КРС.

Рисунок. Динамика накопления вирусных белков в присутствии ГП

     1        2         3        4       5       6      7           8            9      10     11      12        

Дорожка 3, соответствующая  2 часам инкубации культуры с вирусом без добавления препаратов, показывает максимальное накопление вирусных белков; через 4 и 6 часов вирусные белки выявляются слабее, через 8 и 24 часа вирусные белки практически не выявляются. Дорожка 8 соответствует 2 часам инкубации культуры с вирусом, в присутствии ГП. Интенсивность этих полос значительно отличается от контрольной 3 дорожки. Дорожки 9,10, соответствующие 4 и 6 часам инкубации культуры с вирусом в присутствии ГП, также отражают значительное подавление  накопления вирусных белков.

Таким образом, представленные на рисунке данные свидетельствуют о значительном подавлении накопления белков ВД КРС в культуре клеток КСТ в присутствии ГП на ранних сроках (2-6 часов после инфицирования).

         Ежедневное визуальное наблюдение в световом инвертированном микроскопе за клетками, зараженными ВД КРС в присутствии ГП и контрольной культурой, инфицированной вирусом без ГП, показало, что ГП задерживает развитие характерного для ВД КРС цитопатического действия на 24-48 часов по сравнению с контролем.

Обсуждение

          Препараты, действующим веществом которых служат фосфорилированные полипренолы – Фоспренил (содержит полипренолы, выделенные из хвои сибирской пихты) и ГП (содержит полипренолы, выделенные из листьев шелковицы) – исключительно активные в фармакологическом плане соединения. Они обладают не только иммуномодулирующими [1,7,12] и противовирусными [1], но также противовоспалительными [14], адъювантными [5,10] и иными важными свойствами. Противовирусную активность данные препараты проявляют по отношению  к ДНК- и РНК-геномным вирусам, как имеющим оболочку, так и лишенным ее [6,8,11,13].

В представленной работе установлено, что ГП  в дозе 200 мкг обладает способностью значительно (на 1,8 lg) подавлять размножение ВД КРС в культуре КСТ. В то же время механизмы противовирусного действия ГП на этапах взаимодействия вирус-клетка остаются недостаточно изученными. Результаты, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о способности ГП изменять сроки созревания вирусных белков высокоактуального для  ветеринарной медицины ВД КРС в клетках, что может объяснять наблюдаемое снижение инфекционности вируса при воздействии препарата. Не исключено, что одним из механизмов влияния ГП на накопление вирусных частиц является стимуляция продукции клеточного интерферона, что показано в отношении Фоспренила [1,4]. Кроме того, препараты на основе полипренилфосфатов влияют на адсорбцию и проникновение определенных вирусов путем блокирования гликопротеиновых рецепторов, а также, возможно - модификации клеточных мембран. Взаимодействуя с вирионами вне клетки, они препятствуют заражению клеток-мишеней. Вдобавок, с помощью электронной микроскопии установлено, что после воздействия данных препаратов среди выходящих из клетки вирусных частиц попадается много дефектных и интерферирующих (препятствующих репликации других вирусов) вирионов, утративших способность заражать другие клетки-мишени [1,6,12]. Вполне возможно также, что фосфорилированные полипренолы препятствуют пренилированию и гликозилированию вирусных белков в клетках, что служит предметом дальнейших исследований.  

Литература

1. Васильев А.Н. Противовирусная и иммуномодулирующая активность полипренилфосфатов  при  вирусных инфекциях / Васильев А.Н., Ожерелков С.В., Козлов В.В., Пронин А.В., Санин А.В., Парфёнова Т.М., Изместьева А.В.,. Амченкова А.М, Кожевникова Т.Н., Степанова Т.Н., Наровлянский А.Н // Антибиотики и химиотерапия. ― 2008. ― Т. 53. ― №3-4. ― С. 3–8.
2. Глотова Т.И., Противовирусная активность нового химического соединения./ Глотова Т.И., Сильников В.Н., Королева Л.С., Кунгурцева О.В., Тихонов В.Л., Глотов А.Г.//  РВЖ СХЖ― 2012― №1 ―с. 22-24
3. Глотова Т.И. Инфекционный ринотрахеит и вирусная диарея крупного рогатого скота: диагностика, молекулярно-биологические свойства возбудителей, эффективность противовирусных препаратов.// Автореф.дисс.докт.биол.наук ― 2006 Новосибирск― С. 48
4. Годунов Р.С. Иммуномодулирующая и противовирусная активность полипренолов природного происхождения.// Автореф. дисс.канд.мед.наук.   Москва ―  2006― С.24
5. Кожевникова Т.Н. Использование фоспренила в качестве адъюванта для вакцин и стимулятора продукции специфических антител при изготовлении гипериммунных сывороток/ Кожевникова Т.Н., Ворович М.Ф., Козлов В.Г.,Ожерелков С.В., Наровлянский А.Н. , Пронин А.В., Санин А.В.// Росс.ветеринарный журнал МДЖ―  2006 №2―  С.8-10
6. Кожевникова Т.Н. Морапренилфосфаты подавляют размножение вируса энцефаломиелита Тейлера и накопление вирусного белка VP3 в чувствительных культурах клеток BHK-21 и P388D1. / Кожевникова Т.Н.,Викторова Е.Г., Козлов В.Г., Наровлянский А.Н., Санин А.В., Пронин А.В., Ожерелков С.В.// Ж..микробиол. ― 2007.― №3.― С. 26-30.
7. Наровлянский А.Н., Противовирусная активность полипренилфосфатов при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом гепатита С in vitro./ Наровлянский А.Н., Дерябин П.Г., Седов А.М., Санин А.В., Пронин А.В. // Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии ― 2012.―№5. ―  С.80-84.
8. Ожерелков С.В Защитное действие нового противовирусного препарата Фоспренил при экспериментальном клещевом энцефалите/ Ожерелков С.В.,Тимофеев А.В., Новикова Г.П., Деева А.В., Наровлянский А.Н., Санин А.В., Пронин А.В.. // Вопр. Вирусол. ―2000. ―Т.45. ―№ 1. ―С.33-37.
9. Ожерелков С.В. Противовирусное действие препаратов  Фоспренил и Гамапрен  в отношении флавивирусов./ Ожерелков С.В. Кожевникова Т.Н., Наровлянский А.Н., Пронин А.В., Санин А.В. // Ветеринария и кормление. ―2017. ― №3 ―С.78-80
10. Пронин А.В., Ожерелков С.В., Деева А.В., Санин А.В., Наровлянский А.Н. Полипренилфосфаты как адъюванты, поляризующие иммунный ответ в сторону Th1. Инфекция и иммунитет. ―2012. ― Т.2 ―№3. ― С.645-50

11.  Русских В.В. Ринотрахеит кошек : клинико-эпизоотологические аспекты, противовирусная активность препаратов/ Русских В.В. //Диссертация ... кандидата ветеринарных наук ―2009―Новосибирск [Место защиты: Ин-т эксперим. ветеринар. Сибири и Дал. Востока] ― С.131

12.  Санин А.В. Применение иммуномодуляторов при вирусных заболеваниях мелких домашних животных.// Российский ветеринарный журнал. МДЖ. ― 2005. ― №1.― С.38-42

13.  Санин А.В. Применение Гамапрена при лечении вирусных инфекций у кошек./ Санин А.В.,Савойская С.Л., Васильев И.К., Наровлянский А.Н., Пронин А.В., Е.В.Гордеева.// Ветеринария Кубани― 2009.― №6.― С.29-30

14.  Санин А.В. Фосфорилированные полипренолы – новый класс соединений с противовоспалительной и бронхолитической активностью./ Санин А.В., Ганшина И.В., Судьина Г.Ф., Санина В.Ю., Кожевникова Т.Н., Пронин А.В., Наровлянский А.Н., Суханова С.А., Проскурина О.В., Митрохин Н.М. // Инфекция и иммунитет ― 2011 ―Т.1― №4 ―С.355-360.