Ответы на вопросы Статьи Контакты
Из натуральных природных компонентов
Гамапрен

Экспериментальное изучение противовирусной активности Гамапрена при герпесвирусной инфекции in vitro

А.В. Санин1, А.Н. Наровлянский1, А.В. Пронин1, В.Ю.Санина1 ,Т.Н. Кожевникова1, Анна В.Изместьева1, Анастасия В.Изместьева1, А.Д. Агафонова1, И.К.Зубашев, С.В.Ожерелков2, Р.В Белоусова3,

1ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Препарат Гамапрен обладает выраженным противовирусным действием, проявляющимся в отношении герпесвирусов ВИРК, ВИР КРС и ВБА в культуре in vitro.

3ФГБУ «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина»                                        

Experimental study of Gamapren antiviral activity against herpes simplex virus in vitro

Полипренолы

Sanin A.V., Ozherelkov S.V., Narovljanskij A.N., Pronin A.V, Deeva A.V, Kozhevnikova T.N., Zubashev I.K., Agafonova A.D.,  Izmest'eva A.V ., Belousova R.V.

Viruses of the herpes group cause a number of diseases in pets, including feline infectious rhinotracheitis and Aujeszky's disease.  Despite the fact that currently a sufficiently large number of immunomodulators and antiviral agents are used for the treatment and prevention of herpesviral infections, the search of effective therapeutic agents remains an urgent task. It is obvious that such medications should not only suppress the reproduction of the herpes virus and contribute to the correction of viral-induced immunodeficiency, but also meet safety requirements.

The aim of the investigation was to study the effect of Gamapren (GP), the active ingredient of which is phosphorylated polyprenols isolated from mulberry leaves, on the reproduction of various herpesviruses and the maturation of viral proteins in vitro.

It is shown that GP is able to inhibit the reproduction of herpes viruses and maturation of viral proteins in cell culture. Thus, GP at a dose of 200 µg/ml suppressed the maturation of feline rhinotracheitis virus proteins in the sensitive culture of CFRK cells. Also, GP at a dose of 100 µg/ml in suppressed the reproduction of bovine rhinotracheitis virus in the bovine lung embryo cell culture about 100-fold. Also observed was inhibition of the viral cytopathogenic action. In addition, GP significantly reduced the "harvest" of the virus in sensitive cell culture. In yet another protocol we studied the effect of GP on the reproduction of Aujeszky's disease virus and shown that GP inhibited its reproduction in the sensitive cell culture by 2.25 lg CPD50/ ml.

Thus, in the present work we demonstrated the antiviral effect of GP, which is manifested in vitro against 3 different herpes viruses, 2 of which (feline rhinotracheitis virus and Aujeszky's disease virus) inflict diseases in cats.

Key words: antiviral medicines, feline herpesvirus infections, feline rhinotracheitis virus, gamapren, the virus Aujeszky's disease virus, viral protein accumulation, the reproduction of viruses, cell culture                                              

Вирусы группы герпеса вызывают у домашних животных целый ряд заболеваний, среди которых не последнее место занимают инфекционный ринотрахеит кошек и  болезнь Ауески.  Несмотря на то, что в настоящее время для лечения и профилактики герпесвирусных инфекций используется достаточно большое количество иммуномодуляторов и противовирусных средств, поиск и внедрение эффективных лечебных средств остается актуальной задачей. Очевидно, что такие средства должны не только подавлять размножение вируса герпеса и способствовать коррекции вирусиндуцированного иммунодефицита, но и соответствовать требованиям к безопасности.

Цель исследования: изучить влияние препарата Гамапрен (ГП), действующим веществом которого являются фосфорилированные полипренолы, выделенные из листьев шелковицы, на репродукцию различных герпесвирусов и созревание вирусных белков в культуре клеток in vitro.

Показано, что ГП в экспериментах in vitro подавляет  репродукцию герпесвирусов и созревание вирусных белков в культуре клеток. Так, ГП в дозе 200 мкг/мл подавлял созревание  белков ВИРК в чувствительной культуре клеток CFRK. При внесении ГП в дозе 100 мкг/мл в культуру клеток легких эмбрионов коров наблюдали подавление размножения ВИР КРС (вирус герпеса 1-го типа) в 100 раз. При этом наблюдали также торможение развития ЦПД вируса. Кроме того, ГП значительно снижал «урожай» ВИР КРС в чувствительной культуре клеток.

Также в экспериментах по изучению влияния ГП на репродукцию ВБА показано, что ГП угнетает размножение данного вируса в чувствительной культуре клеток КФ на 2,25 lg ЦПД50/мл.

Таким образом, в настоящей работе выявлено противовирусное действие ГП, проявляющееся in vitro по отношению к 3 различным герпесвирусам, 2 из которых (ВИРК и ВБА) играют важную роль в инфекционной патологии у кошек

Ключевые слова: противовирусные препараты, герпесвирусные инфекции кошек, вирус инфекционного ринотрахеита кошек, гамапрен, вирус болезни Ауески, накопление вирусных белков, размножение вирусов, культура клеток

Введение

Вирусы группы герпеса вызывают у домашних животных целый ряд заболеваний – болезнь Ауески, респираторные и глазные заболевания, герпесвирусный энцефалит, инфекционный ринотрахеит кошек и др. Возбудители относятся к семейству герпесвирусов – эти вирусы характеризуются наличием липопротеиновой оболочки и содержат 2-цепочечную ДНК [13]. На основании фенотипических и генетических данных семейство герпесвирусов подразделяют на 3 подсемейства: α-, b-, и  g-герпесвирусов. Несмотря на то, что в настоящее время для лечения и профилактики герпеса используется достаточно большое количество иммуномодуляторов и противовирусных средств, поиск и внедрение препаратов, повышающих резистентность к герпетической инфекции, остается актуальной задачей [13]. Очевидно, что подобные препараты должны не только подавлять размножение вируса герпеса и способствовать коррекции вирусиндуцированного иммунодефицита, но и соответствовать требованиям к безопасности, включающим отсутствие токсичности, аллергенности и реактогенности.

В предыдущих исследованиях было показано, что  фосфорилированные полипренолы подавляют размножение ряда вирусов в чувствительных культурах клеток, а также обладают терапевтической активностью при лечении вирусных заболеваний мелких домашних животных [1, 5-7, 10,11].

Цель исследования: изучить влияние препарата Гамапрен (ГП), действующим веществом которого являются фосфорилированные полипренолы, выделенные из листьев шелковицы, на репродукцию различных герпесвирусов и созревание вирусных белков в культуре клеток in vitro.

Сокращения: Гамапрен (ГП), вирус инфекционного ринотрахеита кошек (ВИРК), вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ВИР  КРС), вирус болезни Ауески (ВБА), ТЦД50 (тканевая цитопатогенная доза, вызывающая гибель 50% клеток монослоя), Polyprenyl  Immunostimulant  (PI),  (ЛЭК) - культура клеток легких эмбрионов коров

Материалы и методы

Животные. В опытах использовали аутбредных беспородных мышей обоего пола массой 10-12 г, полученных из питомника «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России.

Гамапрен. Использовали коммерческий препарат ГП производства ООО «ГамаВетФарм», 0,5%. В экспериментах применяли ГП в дозах от 80 до 200 мкг/мл.

В качестве препарата сравнения использовали  Ридостин производства ЗАО «Вектор-Медика», п.Кольцово Новосибирской области, содержащий 8 мг активного вещества в 1 мл. Использовали дозу 200 мкг/мышь, обычно применяемую у мышей при моделировании  инфекции.

Вирусы. Вирус инфекционного ринотрахеита кошек (ВИРК), штамм Гранд,  с активностью 6.5 lg ТЦД50/мл был получен из музея ВГНКИ ветеринарных препаратов.

Вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ВИР  КРС), штамм 4016 (герпесвирус 1-го типа) был получен с кафедры ветеринарной вирусологии биологического факультета МВА имени К.И. Скрябина.

Вирус болезни Ауески (ВБА), штамм ГНКИ, был получен из музея ВГНКИ ветеринарных препаратов.

Культуры клеток.

В качестве субстрата для размножения ВИРК, штамм Гранд,  использовали перевиваемую культуру почек кошек CFRK, полученную из лаборатории вирусных инфекций ВГНКИ ветеринарных препаратов.

ВИР  КРС, штамм 4016 пассировали и титровали на чувствительной перевиваемой культуре клеток легких эмбрионов коров (ЛЭК). Титры вирусов оценивали по показателю lg ЦПД50/мл

ВБА поддерживали на чувствительной культуре куриных фибробластов (КФ).

Сыворотка. Использовали гипериммунную поликлональную сыворотку, полученную от кошек, переболевших инфекционным ринотрахеитом. Сыворотка была получена из лаборатории вирусных инфекций ВГНКИ ветеринарных препаратов.

Схемы экспериментов

1.Влияние ГП на созревание белков ВИРТ

Трехдневную культуру клеток CFRK, посаженную в стандартные культуральные флаконы (S=25см2), заражали ВИРК с множественностью заражения »5–10 БОЕ/кл. Схема заражения представлена в таблице 1.

Таблица 1.Схема заражения клеток CFRK ВИРК в присутствии ГП (200 мкг/мл)

Номер пробы

ВИРК

Среда поддержки

1

МЕМ двойная

2

+

МЕМ двойная

3

+

МЕМ двойная + ГП

После полуторачасовой адсорбции клеток с вирусом при +37°С во флаконы вносили по 2 мл среды для мечения, включавшей: раствор Эрла (+ ГП, 200мкг/мл) – 3 мл,  среду поддержки МЕМ двойная – 3 мл; [35S]- меченный метионин – 21 мкл. Через 24 часа после начала мечения во все флаконы добавляли по 400 мкл РИП–буфера (Трис–HCl10 мМ рН 8.0, NaCl0.13 М, ЭДТА 1 мМ, NP–40 1 %, апротинин 500 ед./мл, 1мМ ПМСФ) и помещали в морозильную камеру на –70°С. Все флаконы были трижды подвергнуты замораживанию и оттаиванию. Полученный экстракт собирали в микроцентрифужные пробирки (МЦП). Препараты двукратно осветляли на миницентрифуге в течение 20 мин при 14 тыс. мин-1. Из супернатанта в МЦП отбирали аликвоты по 180 мкл. Ко всем аликвотам добавляли по 10 мкл поливалентной сыворотки к ВИРТ. Реакционную смесь помещали на 12 часов при +4°С. Одновременно с приготовлением реакционных смесей оставили набухать протеинА–сефарозу (ПАС) в РИП–буфере (соотношение объемов — 1:1). На следующий день ПАС трехкратно промывали равным объемом РИП–буфера. Осадок ресуспендировали в равном объеме РИП–буфера и добавляли по 50 мкл суспензии во все пробы. Образцы инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре, встряхивая каждые 20 минут. По окончании инкубации пробы центрифугировали в течение 10 мин при 6 тыс. мин-1. Затем промывали 5 раз 1 мл промывочного W–буфера (Трис–HCl10 мМ рН 8.0, NaCl0.15 М, ЭДТА 1 мМ, NP–40 0.01 %). К пробам после промывки добавляли по 20 мкл S–буфера для нанесения на гель (Трис–HCl 0.0625 М рН 6.8, глицерин 20 %, b–меркаптоэтанол 10 %, додецилсульфат натрия (Дс–Na) 2 %, бромфеноловый синий на кончике шпателя), пробы прогревали при +95°С в течение 10 минут и оставляли на 12 часов в холодильнике при +4°С.

На следующий день проводили гель–электрофорез в денатурирующих условиях (1 % Дс–Na) по Лэммли в 10 % полиакриламидном геле (ПААГ). Вместе с пробами в одну дорожку был помещен маркер молекулярного веса. В качестве белковых маркеров использовали смесь №4 (Pharmacia, Швеция) следующего состава: фосфорилаза в ( 94.000 Да), БСА (67.000 Да), овальбумин ( 43.000 Да), карбоновая ангидраза ( 30.000 Да), ингибитор трипсина (20.000 Да), L- лактоальбумин (14.000 Да). Разделение заканчивали в момент выхода из геля краски (бромфенолового синего). Гели фиксировали в течение 1 часа в водном растворе, содержащем 10 % этанола 96 %, 20 % ледяной уксусной кислоты. Фиксированные гели отмывали водой до исчезновения запаха уксусной кислоты. Далее проводили окраску гелей с помощью красителя Кумасси R-250 в течение 2 часов.  После окраски гель отмывали в растворе, содержащем 25% этилового спирта и 7% уксусной кислоты. Затем гель четырехкратно обрабатывали безводным диметилсульфоксидом по 20 мин и инкубировали в течение 1 часа при + 20°С в 20 %–ном растворе сцинтиллятора (PPO) в диметилсульфоксиде. По окончании обработки гелей их сушили на вакуумной сушке при температуре +80°С в течение 30 мин. Далее сухие пластины закладывали в рентгенографическую кассету с пленкой Kodak на 10 суток в холодильную камеру на –70°С.

2.Влияние ГП на репродукцию ВИР КРС

ВИР КРС титровали в присутствии ГП, который добавляли в каждое разведение вируса в дозах 100 и 80 мкг/мл, препарат до нужной концентрации разводили поддерживающей средой Игла МЕМ. В качестве контроля использовали раствор плацебо, разведенный поддерживающей средой 1 : 40.

В каждом опыте проводили контроль на токсичность ГП.

 После заражения контрольные и экспериментальные пробирки с клетками помещали в термостат и содержали при + 37° С в течение  5-и суток, проводя ежедневные визуальные наблюдения за состоянием культур клеток

 Рeзультаты титрования оценивали в lg ЦПД50/мл.

3.Исследование изменений вирулентности «урожая» внутриклеточных и внеклеточных вирионов, полученных при титровании ВИР КРС в  культуре клеток ЛЭК в присутствии ГП.

Для изучения полученного «урожая» внутриклеточных и внеклеточныхвирионов пробирки с клетками, заражёнными вирусом ВИР КРС в разведениях 10-3 ,10–4, 10–5, 10,–6  10-7объединяли из 4-х для каждого разведения в одну пробирку,получая тем самым по 2 пробы (контрольную и опытную) для каждого разведения вируса. Клетки в исследуемых пробах разрушали методом последовательного замораживания при -700С и оттаивания с целью получения внутриклеточных вирионов. Полученные пробы титровали на свежих (48-часовых) клетках ЛЭК путем приготовления серийных разведений от 10 –1 до 10-6 для каждой пробы и вносили по 1 мл  в пробирки с монослоем клеток (по 4 на каждое разведение). Далее в течение 5-ти суток проводили ежедневное визуальное наблюдение за состоянием монослоя клеток  в контрольных и опытных пробирках. Проявление ЦПД вируса оценивали стандартным методом  (+/- ). Титры  вируса определяли методом Кербера (1 пробирка –      0,25 lg ЦПД50).

4. Влияние ГП на репродукцию  ВБА

После образования монослоя КФ из лунок полностью отсасывали поддерживающую среду и вносили:

  • -в контрольные лунки – ВБА  (по 0,2 мл) в последовательных разведениях от      - 2  до - 7  (по 4 лунки на каждое разведение)
  • -в экспериментальные – ВБА (по 0,2 мл), разведенному поддерживающей средой 199 на р-ре Хенкса, содержащей 200 мкг ГП исследуемых серий в аналогичных контрольным разведениях  от –2 до – 7
  • -дополнительным контролем служили КФ, куда вносили не содержащий вируса ГП в дозах 200 мкг/0,2 мл

После этого проводили ежедневное визуальное наблюдение за состоянием монослоя КФ в инверсионном микроскопе в течение 5-и суток. Проявление ЦПД вируса оценивали стандартным методом : +, ++, +++, ++++  

Результаты и обсуждение

1. Влияние ГП на созревание белков ВИРК

На радиоавтографе (Рис.1) приведены результаты анализа лизированных клеток с поликлональной сывороткой кошек против ВИРК.

Рис 1. Влияние ГП на созревание белков ВИРК  в чувствительной культуре клеток CFRK через 24 часа после инфицирования клеток.

Инвитро

Дорожка 1: Белки в клетках (без ВИРК)

Дорожка 2: Белки в клетках, инфицированных ВИРК без добавления ГП

Дорожка 3: Белки в клетках, инфицированных ВИРК в присутствии ГП

                    (200 мкг/мл)

Данные, представленные на Рис. 1, показывают влияние ГП в дозе 200 мкг/мл на созревание  белков ВИРК через 24 часа после инфицирования культуры клеток (дорожки №2 и 3): ГП в использованной дозе подавляет накопление белков ВИРК в чувствительной культуре клеток CFRK.

  1. Влияние ГП на размножение ВИР КРС in vitro

 Аналогичную картину наблюдали при изучении влияния ГП на размножение ВИР КРС в культуре клеток ЛЭК. Данные, представленные в табл.2, демонстрируют значительную противовирусную активность препарата в отношении вируса герпеса 1-го типа. Так, в культурах, в которые вносили ВИР КРС и ГП в дозе 100 мкг/мл, титр вируса был в 100 раз ниже, чем в клетках, инфицированных ВИР КРС без добавления препарата (1-я и 3-я пробы). При этом наблюдали торможение развития ЦПД вируса, внесенного в культуру клеток вместе с препаратом на 24-48 часов, по сравнению с таковым в контрольных заражённых клетках.

Таблица 2. Противовирусная активность ГП в отношении ВИР КРС in vitro

№№  Название проб

  Титры  ВИР КРС

     (lg ЦПД50/мл)

   Токсичность 

       (+/-)

1. Контроль вируса

           3,5 ± 0,5     

 

         -

2. Контроль плацебо

           3,25± 0,25**

        -

3. Вирус + ГП

(100  мкг/мл)

 

            1,75 ± 0,25 *

 

        -

4. Контроль токсичности

   ГП

 

 

       -

* - Разница между соответствующими показателями в пробах 1 и 3; 2 и 3 статистически достоверна при Р< 0,05

** - и недостоверна между пробами 1 и 2 при Р> 0,05

3. Влияние ГП на вирулентность «урожая» внутриклеточных и внеклеточных вирионов, полученных при титровании ВИР КРС в  культуре клеток ЛЭК

Результаты титрования представлены в Таблице 3.

Табл.3 Влияние ГП на вирулентность «урожая» внутриклеточных и внеклеточных вирионов, полученных при титровании ВИР КРС в  культуре клеток ЛЭК

Название пробы

      Титр вируса

lg ЦПД50/мл

Проявление ЦПД

в исходных пробах

1. Контроль исходный

              5,0

 

2. Опыт исходный

              4,0

 

 

3.Контроль 10-3

 

              8,0

 

     ++++

4. Опыт       10-3

              7,0

     ++++

 

5. Контроль 10-4

 

              5,5

 

     ++++

6. Опыт        10-4

              4,5

     ++++

 

7. Контроль 10-5

 

              5,5

 

     ++++

8. Опыт        10-5

              4,5

        -

 

9. Контроль 10-6

 

               5,0

 

        -

 

10. Опыт      10-6

               0

        -

 

11. Контроль 10-7

 

 

              1,5

 

         -

12. Опыт        10-7

              0

         -

В результате проведенных исследований было установлено, что титры ВИР КРС в «урожае», полученном на клетках ЛЭК при добавлении ГП, в 10 раз меньше, чем титр ВИР КРС в контроле при одинаковом проявлении ЦПД в исходных пробах   /++++/( пробы 3 и 4; 5 и 6).

Результаты титрования вируса в пробах 7 и 8 показали, что при отсутствии проявления ЦПД в опытной пробе 8 /-/ вирус выявлялся в  титре 4,5 lg, в то время как в контрольной пробе 7 при выраженном  проявлении ЦПД /++++/ титр вируса в 10 раз больше (5,5 lg).

Исследование урожая вируса в контрольных и опытных пробах (9 и 10;  11 и 12) позволило установить, что при полном отсутствии ЦПД /-/, как в контрольных, так и в опытных первичных пробах, вирус при пассаже на свежих клетках выявлялся в контроле в достаточно высоких титрах  5 – 1 lg, тогда как в пробах клеток с ГП инфекционный титр вируса не выявлялся. Таким образом, ГП значительно снижает «урожай» ВИР КРС в чувствительной культуре клеток.

4.Исследование противовирусной активности ГП в отношении вируса болезни Ауески in vitro

Под действием ГП наблюдали подавление репродукции ВБА на 2,25 lg ЦПД50/мл (табл.4).

Таблица 4. Противовирусное действие ГП в отношении ВБА in vitro

Разведения ВА

Контроль вируса

      ВБА + ГП

        - 2

     ++++

     + + + +

       -  3

     ++++

     + + + +

       -  4

     ++++

     + - - -

       -  5

     ++++

     - - - -

       -  6

     ++ - -

     - - - -

       -  7

     + - - -

     - - - -

       -  8

     - - - -

     - - - -

Титры ВБА               

lg ЦПД50/мл

 

5,5±0,4

3,25±0,25

В предыдущих исследованиях было показано, что препарат ГП, действующим веществом которого являются фосфорилированные полипренолы, выделенные из листьев шелковицы, обладает иммуномодулирующими и противовирусными свойствами, которые проявляются в отношении инфекций, вызванных различными вирусами как in vitro, так и in vivo [2-4, 8,9]. В настоящей работе показано, что ГП в экспериментах in vitro подавляет  репродукцию герпесвирусов и созревание вирусных белков в культуре клеток.

Установлено, что ГП в дозе 200 мкг/мл подавляет созревание  белков ВИРК в чувствительной культуре клеток CFRK. При внесении ГП в дозе 100 мкг/мл в культуру клеток ЛЭК наблюдали подавление размножения ВИР КРС (вирус герпеса 1-го типа) в 100 раз. При этом наблюдали также торможение развития ЦПД вируса. Кроме того, ГП значительно снижает «урожай» ВИР КРС в чувствительной культуре клеток. В экспериментах по изучению влияния ГП на репродукцию ВБА показано, что ГП угнетает размножение данного вируса в чувствительной культуре клеток КФ на 2,25 lg ЦПД50/мл.

Таким образом, в настоящей работе выявлено противовирусное действие ГП, проявляющееся in vitro по отношению к 3 различным герпесвирусам, 2 из которых (ВИРК и ВБА) играют важную роль в инфекционной патологии у кошек.

В настоящее время большинство противовирусных препаратов, применяющихся для борьбы с герпесвирусными инфекциями кошек, представляют собой аналоги тех или иных нуклеотидов или нуклеозидов  ДНК вируса, либо ингибиторы вирусной ДНК-полимеразы, и их безопасность зависит, в значительной степени, от того, насколько специфично их воздействие на вирус [16]. Не случайно, в связи с этим, что одним из немногих противовирусных препаратов, разрешенных в США для лечения кошачьего ринотрахеита, одного из самых распространенных инфекционных заболеваний домашних кошек [12], является Polyprenyl  Immunostimulant  (PI), безопасность которого, как и ГП, подтверждена клиническими испытаниями [14]. Препарат ГП был создан в результате совместной Российско-американской разработки в рамках проекта МНТЦ. Препарат PI был создан параллельно в США в результате совместной Российско-американской разработки в рамках проекта МНТЦ. Итогом проекта стал параллельный выпуск в России препарата ГП, а в США – препарата PI, различие между которыми состоит только в том, что фосфорилированные полипренолы ГП получают из листьев шелковицы, произрастающей на юге РФ, а сырьем для PI служит шелковица, распространенная в США. Кроме того, концентрация действующего вещества в ГП 0,5%, а в PI– 0,25%. И ГП и PI первоначально зарегистрированы для лечения герпесвирусных инфекций кошек, однако PI также проявил эффективность в контролируемых клинических испытаниях при сухой форме кошачьего инфекционного перитонита [15]. Об аналогичных свойствах ГП ранее также сообщалось в отечественных публикациях [11]. 

Вывод: препарат ГП обладает выраженным противовирусным действием, проявляющимся в отношении герпесвирусов ВИРК, ВИР  КРС и ВБА в культуре in vitro.

Литература

1. Васильев А.Н. Противовирусная и иммуномодулирующая активность полипренилфосфатов  при  вирусных инфекциях / Васильев А.Н., Ожерелков С.В., Козлов В.В., Пронин А.В., Санин А.В., Парфёнова Т.М., Изместьева А.В.,. Амченкова А.М, Кожевникова Т.Н., Степанова Т.Н., Наровлянский А.Н // Антибиотики и химиотерапия. ― 2008. ― Т. 53. ― №3-4. ― С. 3–8.

2. Глотова Т.И., Противовирусная активность нового химического соединения./ Глотова Т.И., Сильников В.Н., Королева Л.С., Кунгурцева О.В., Тихонов В.Л., Глотов А.Г.//  РВЖ СХЖ― 2012― №1 ―с. 22-24

3.Глотова Т.И. Противовирусная активность нового средства   Гамапрен  в отношении вируса ринотрахеита кошек/ Глотова Т.И.   Глотов А.Г., Русских В.В., Тугунова Т.Б.//  Сибирский вестник сельскохозяйственной науки  ― 2008. ― № 10 ―С.63-68

4.Изместьева А.В. Иммуномодулирующая и противовирусная активность морапренилфосфатов (МПФ) / Изместьева А.В.,  Саличев А.В., Мезенцева М.В., Березина Л.К., Ольшанская А.А., Амченкова А.М., Зубашев И.К., Козлов В.С., Ожерелков С.В., Пронин А.В., Санин А.В., Наровлянский А.Н.// СпБ 2011 Мед.иммунол. ―2011. ― Т.13 ―№4-5, ―С.522-3

5. Кожевникова Т.Н. Морапренилфосфаты подавляют размножение вируса энцефаломиелита Тейлера и накопление вирусного белка VP3 в чувствительных культурах клеток BHK-21 и P388D1. / Кожевникова Т.Н.,Викторова Е.Г., Козлов В.Г., Наровлянский А.Н., Санин А.В., Пронин А.В., Ожерелков С.В.// Ж..микробиол. ― 2007.― №3.― С. 26-30.

6.Кожевникова Т.Н. Влияние препаратов гамапрен и фоспренил, созданных на основе полипренолов растительного происхождения, на продукцию некоторых регуляторных цитокинов в норме и при экспериментальном клещевом энцефалите у мышей /Кожевникова Т.Н., Ожерелков С.В., Изместьева А.В., Санина В.Ю., Наровлянский А.Н., Пронин А.В., Санин А.В.// Российский иммунологический журнал. ―2008. ― Т. 11. ― № 2-3. ―С. 250.

7.Наровлянский А.Н Противовирусная активность полипренилфосфатов при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом гепатита С in vitro./ Наровлянский А.Н, Дерябин П.Г., Седов А.М., Санин А.В., Пронин А.В.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. ―2012.― № 5. ― С. 80-84.

8. Русских В.В. Ринотрахеит кошек : клинико-эпизоотологические аспекты, противовирусная активность препаратов/ Русских В.В. //Диссертация ... кандидата ветеринарных наук ―2009―Новосибирск [Место защиты: Ин-т эксперим. ветеринар. Сибири и Дал. Востока] ― С.131

9. Санин А.В. Применение Гамапрена при лечении вирусных инфекций у кошек./ Санин А.В.,Савойская С.Л., Васильев И.К., Наровлянский А.Н., Пронин А.В., Е.В.Гордеева.// Ветеринария Кубани― 2009.― №6.― С.29-30

 10.Санин А.В Иммуномодуляторы в ветеринарной практике – применение и противоречия/. Санин А.В.,  Наровлянский А.Н., Ожерелков С.В., Пронин А.В., Санина В.Ю//. Ветеринарная клиника. ―2008.― № ―С.10-12.

11.Фурман И.М., Применение препаратов на основе растительных полипренолов при различных формах кошачьего инфекционного перитонита/. Фурман И.М.,  Васильев И.К., Наровлянский А.Н., Пронин А.В., Cанин А.В.//  Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. ― 2010. ― № 3. ― С. 42-44.

12. Gaskell R.M Feline Respiratory Disease./ Gaskell R.M, Dawson S., Radford A.// 4th ed. In: Greene C.E., editor. Infectious Diseases of the Dog and  Cat. St.Louis: Elsevier Saunders― 2012. ― P.151-164

13. Looker, KJ; Garnett, GP; Schmid, GP (October 2008). "An estimate of the global prevalence and incidence of herpes simplex virus type 2 infection". Bulletin of the World Health Organization.―86 (10):―805–12

14.Legendre AM, Polyprenyl Immunostimulant in Feline Rhinotracheitis: Randomized Placebo-Controlled Experimental and Field Safety Studies./ Legendre AM, Kuritz T, Heidel RE, Baylor VM // Front. Vet Sci. 27 February 2017  https://doi.org/10.3389/fvets.....

15. Legendre AM,. Polyprenyl Immunostimulant Treatment of Cats with Presumptive Non-Effusive Feline Infectious Peritonitis/ Legendre AM Kuritz T, Galyon G, Baylor VM, Heidel RE// In a Field Study. Front Vet Sci. 2017 Feb 14; 4:7. https://doi.org/10.3389/fvets....

16.  Thomasy S. M.,   A review of antiviral drugs and other compounds with activity against feline herpesvirus-1. / Thomasy S. M., Maggs D. J. //Vet Ophthalmol. 2016. 19(Suppl 1): ―P.119–130.