Клиническая эффективность Гамапрена при калицивирусной инфекции кошек

Clinical efficacy of Gamapren in the treatment of feline calicivirus infection: a controlled study

A.V. Sanin, V.V. Annikov, A.E. Rasstrigin, T.E. Zaripova, A.N. Narovlyansky, A.V. Pronin, V.Yu. Sanina, T.N. Kozhevnikova

Feline calicivirus infection is an acute infectious disease characterized by lesions of the respiratory tract, clinically manifested by formation of ulcers on the mucous membrane of the mouth and rarely on the skin in the back of the nose. The causative agent is a non-enveloped RNA-containing virus from the Caliciviridae family. Under observation there were 15 kittens with caliciviruses infection, which were divided into 3 groups of 5 animals in each. The control group was treated only by etiotropic therapy, which included intramuscular injections of ceftriaxone once a day during 5 days (for the suppression of secondary bacterial infections) and sanation of the oral mucosa with chlorhexidine. The experimental groups I and II were additionally treated with Gamaprene – 2 times a day at the recommended dose for 5 days, subcutaneously or orally, respectively. All animals received commercial moist food. The use of gamaprene shortened the periods of clinical recovery, contributed to a significant increase in the level of globulins and total protein in comparison with the control, reduced the acute inflammatory reaction and restored the normal level of transferases. This immunomodulator showed a similar therapeutic efficacy in both administration protocols. Keywords: calicivirosis, cat, gamapren, immunomodulators, infections, phosphorylated polyprenols, therapy, viruses.

Калицивирусная инфекция кошек – острое инфекционное заболевание, характеризующееся поражением респираторного тракта, клинически проявляющееся образованием язв на слизистой оболочке ротовой полости, реже на коже спинки носа [23]. Болеют в основном котята, 10 – 30 % из них погибает [17]. Болезнь вызывает безоболочечный РНК-содержащий вирус из семейства Caliciviridae [20].

Лечение заболевших калицивирозом животных обычно проводят гипериммунной сывороткой и иммуномодуляторами. Особенно эффективны иммуномодуляторы, обладающие противовирусной активностью, в том числе препараты на основе фосфорилированных полипренолов различного происхождения.

Цель работы – оценить эффективность Гамапрена^® (ГП), действующим веществом, которого являются фосфорилированные полипренолы, для лечения кошек, больных  калицивирозом.  

Материалы и методы. Под наблюдением в условиях стационара находилось 15 больных калицивирозом котят в возрасте 2 – 4 месяцев обоего пола разных пород (персидская, экзотическая, мейн-кун, метисы). Первичный диагноз ставили по наличию клинических признаков: отказ от корма и воды, угнетенное состояние, гиперсаливация, чихание и сопящее дыхание, у части животных температура тела была выше 39,7 ⁰С, появление в ротовой полости (на кончике и/или корне языка, деснах, небе, щечной области)  красных, болезненных и кровоточащих язв диаметром 1 – 10 мм. На основании результатов исследования в ПЦР исключали ринотрахеит, микоплазмоз и хламидиоз.

Животных с диагнозом  калицивирусная инфекция разделили по принципу аналогов на контрольную и 2 опытные группы (по 5 голов в каждой). Котятам контрольной группы проводили только этиотропную терапию, включавшую внутримышечные инъекции цефтриаксона – 1 раз в день на протяжении 5 дней (для подавления вторичных бактериальных инфекций) и санацию слизистой оболочки ротовой полости хлоргексидином (Доктор ВИК). Особям первой и второй опытных групп соответственно подкожно и перорально дополнительно применяли Гамапрен^®  (серия 430103182, ООО «ГамаВетФарм») в рекомендованной инструкцией дозе 2 раза в день в течение 5 дней.  Все животные получали готовый диетический влажный корм.

Анализы крови котят проводили на гемоанализаторе «Mindray BC-2300» (КНР) с  помощью стандартных реагентов. СОЭ измеряли на аппарате Панченкова, а клетки крови подсчитывали в мазках, окрашенных набором Лейкодиф-200. Биохимические показатели сыворотки крови определяли до начала лечения, затем на 1-, 3- и 5-е сутки терапии на анализаторе «Sinnova BS-3000P» (КНР) с использованием реактивов фирмы «Диакон ДДС».

Полученные данные статистически обрабатывали с помощью программы Statistica 6.

Результаты исследований и обсуждение.  Через 1 сутки после начала лечения 3 котенка из первой и 2 из второй опытных групп начали пить воду и обнюхивать миску с едой.  У животных этих  же  групп  ослабла  гиперсаливация, чихание стало реже, дыхание чище. У  котят контрольной группы в некоторой степени уменьшилось слюнотечение.  При пальпации изменений подчелюстных лимфатических узлов не выявили.

Спустя  3 суток кошки опытных групп  начали активно принимать корм и воду. У них исчезли гиперсаливация, носовые истечения, сопящее дыхание, ректальная температура соответствовала норме.  В ротовой полости отметили ослабление воспалительной реакции,  язвы стали бледно-розовыми, а их границы – местами стертыми, причем у части животных маленькие язвы (диаметром до 1 мм) полностью исчезли. В этот период  2 контрольных котенка начали пить воду, у них исчезли истечения из носа и рта, нормализовалось дыхание. При осмотре ротовой полости у них наблюдали ослабление воспаления слизистой оболочки – язвы стали бледно-розовыми.  Одно контрольное животное погибло. При его вскрытии констатировали кахексию, катаральный стоматит, цианоз слизистых оболочек, гнойную пневмонию. У остальных  2 контрольных котят клиническое состояние ухудшилось: они перестали передвигаться, возникли признаки дегидратации. Цвет язв в ротовой полости хотя и стал бледно-розовым, но животные по-прежнему отказывались от корма. Их слюна приобрела вязкую консистенцию, проявились галитоз и катарально-гнойный конъюнктивит, увеличились подчелюстные лимфатические узлы. Учитывая критическое состояние этих котят, приняли решить включить в их схему лечения Гамапрен^® и провести регидратацию физиологическим раствором.

Через 5 суток после начала лечения большинства животных опытных групп клинически выздоровело. Только у  2 котят первой и  1 животного второй опытных группы  на кончике языка сохранились слабо эпителизированные язвы, что, впрочем, не мешало приему корма. Интенсивная терапия котят контрольной группы также дала положительный результат – исчезла дегидратация, уменьшилась интенсивность воспаления конъюнктивы, животные стали передвигаться и пить воду. Однако, аппетит у них по-прежнему отсутствовал.

Изменения гематологических показателей кошек, больных  калицивирозом, в процессе лечения представлены  таблице 1. В начале эксперимента у животных всех групп отметили повышенную СОЭ и лейкоцитоз, обусловленный виремией.

Спустя 1 сутки после начала лечения в крови котят опытных групп СОЭ понизилась и незначительно возросли уровень гемоглобина и гематокрита, а также количество эритроцитов в крови. У животных контрольной группы в это время гематологические показатели демонстрировали отрицательную динамику.

Через 3 суток у животных опытных и контрольной группы проявились существенные различия гематологических показателей. У котят, которым применяли Гамапрен^®, в еще большей степени повысилось количество эритроцитов, уровень гемоглобина и гематокрита, незначительно ослаб лейкоцитоз. У контрольных аналогов резко уменьшилось количество лейкоцитов в крови, а остальные гематологические показатели претерпели противоположные (по сравнению с опытными группами) изменения. СОЭ уменьшилась во всех группах.

На 5-е сутки терапии регистрировали восстановление всех тестируемых  гематологических показателей у котят опытных и контрольной группы. В крови контрольных животных уровень гемоглобина, гематокрита и количество эритроцитов к этому сроку находились на нижних границах референсных значений, это по-видимому связано с депрессией эритроцитарного ростка гемопоэза костного мозга. Относительная лейкопения при высокой концентрации С-реактивного белка в крови (табл. 2) может свидетельствовать о наличии вторичного иммунодефицита, возникшего в результате прогрессирования калицивирусной инфекции.

Таблица 1

Динамика гематологических изменений в процессе лечения кошек с калицивирусной инфекцией (n=15, M ± m)

Примечание. О I – первая опытная группа; О II – вторая опытная группа; КГ – контрольная группа.

Изменения биохимических показателей крови кошек с калицивирозом в процессе лечения приведены в таблице 2. В начале опыта в сыворотке крови животных всех групп регистрировали повышенную активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ) – маркеров острого воспаления и реактивного гепатита. Увеличение концентрации в крови С-реактивного белка подтверждает наличие воспалительной реакции. Кроме того, значительное снижение содержания в сыворотке общего белка за счет глобулиновых фракций, по всей видимости, свидетельствует о депрессии гуморального звена иммунитета.

Через 1 сутки после начала лечения у кошек опытных групп отметили позитивную тенденцию повышения содержания в сыворотке общего белка и снижения активности трансфераз. В группе контроля, наоборот, активность этих ферментов возросла, а уровень общего белка продолжил снижаться. Спустя 3 суток уровень трансфераз в сыворотке крови  животных обеих опытных групп понизился до верхних границ физиологической нормы, что характерно для этапа реконвалесценции, а у контрольных кошек активность этих ферментов осталась неизменной. Содержание общего белка продолжало увеличиваться в крови животных  опытных группах в основном за счет глобулиновых фракций (активизация гуморального звена иммунитета).

На 5-е сутки терапии у кошек опытных групп активность трансфераз достигла референсных значений. У контрольных животных в этот период уровень  АлАТ продолжал увеличиваться, что в сочетании с высокой концентрацией С-реактивного белка указывало на развитие реактивного гепатита.

Таблица 2

Динамика биохимических изменений сыворотки крови в процессе лечения кошек с калицивирусной инфекцией (n=15, M ± m)

Примечание. О I – первая опытная группа; О II – вторая опытная группа; КГ – контрольная группа; «–» –  отсутствие; «+» – слабо выраженная воспалительная реакция «++» – значительно выражена воспалительная реакция

Таким образом, до начала опыта у кошек всех групп наблюдали  наличие острой воспалительной реакции, о чем свидетельствует повышение СОЭ, а также уровней АлАТ, АсАТ и С-реактивного белка. На этом фоне проявилось угнетение гемопоэза, следствиями чего стали относительные анемия, эритропения, пониженный гематокрит, а также ослабление гуморального звена иммунитета, о чем можно судить по резкому уменьшению концентрации в сыворотке крови общего белка и глобулинов.

Включение в схему лечения заболевших калицивирозом котят Гамапрена^®  позволило избежать летальных исходов  и перехода болезни в хроническую стадию. Ослабление воспалительной реакции отметили уже через 1 сутки терапии. Такой эффект характерен для фосфорилированных полипренолов, подавляющих активность 5- и 15-липоксигеназ [13], а также контррегулирующих действие важнейшего провоспалительного цитокина – фактора ингибиции миграции макрофагов [15]. В результате этого снижается риск развития реактивного гепатита, о чем косвенно свидетельствует снижение активности АлАТ.  Все это способствует исчезновению вторичного иммунодефицита, признаки которого (анемия, эритропения) проявились на старте терапии. Гамапрен^®  активизировал гуморальный иммунитет – уже к  3-м суткам лечения исчез дефицит концентрации глобулинов в сыворотке крови котят. Не отмечено статистически достоверной разницы в результатах лечения и динамике выздоровления животных при пероральном и парентеральном применении препарата.

Известно, что иммуномодуляторы на основе фосфорилированных полипренолов, Фоспренил (ФП) и Гамапрен^®  подавляют размножение ряда вирусов в чувствительных культурах клеток [1, 2, 5, 7],  обладают профилактической и терапевтической эффективностью при  экспериментальных вирусных инфекциях [2, 4, 8, 15] и вирусных заболеваниях мелких домашних животных [9, 10 – 12, 16].  Они активны как в отношении оболочечных (вирус чумы плотоядных, вирусы герпеса, коронавирусы, флавивирусы), так и безоболочечных (вирусы гепатита А, энцефаломиелита мышей Тейлера, парвовирусы, аденовирусы и папилломавирусы) агентов [9, 10 – 12, 15, 16]. В отношении оболочечных вирусов некоторые механизмы противовирусной активности фосфорилированных полипренолов выяснены: это препятствие проникновению агентов в клетки-мишени, нарушение синтеза, пренилирования и гликозилирования вирусных белков, образование дефектных вирионов и т.д. Что касается их влияния на вирусы, лишенные оболочки, то показано, что Гамапрен^®  подавляет размножение возбудителя энцефаломиелита Тейлера за счет ингибирования синтеза вирусного белка VP3 [5].  В то же время известно, что многие безоболочечные вирусы (парвовирусы, аденовирусы, пикорнавирусы, калицивирус кошек) для инфицирования клеток используют опосредованный клатрином эндоцитоз [26,  27].  Другие вирусы, лишенные оболочки, например, обезьяний вирус SV 40, используют для проникновения в клетку кавеолы, избегая таким образом деградации в лизосомах [25], тогда как человеческий echovirus 11 и вирус Коксаки В4 проникают в клетку благодаря холестеринзависимому механизму через липидные рафты (плоты) – наноструктурные комплексы холестерина и сфинголипидов [27, 30]. За поддержание целостности рафтов отвечает холестерин, выполняющий роль своеобразной подвижной распорки между молекулами сфинголипида. Ее удаление приводит к потере функциональной активности рафта [26]. Кавеолы участвуют в различных клеточных процессах, включая мембранный транспорт и формирование ответа на внешний сигнал. С трансмембранной передачей сигнала, которая, по-видимому, осуществляется в рафтах и, возможно, кавеолах, связаны рецепторы инсулина и других факторов роста, а также некоторых GTP-связывающих белков и протеинкиназ. Кроме того, кавеолы участвуют в регуляции мембранных каналов и кальциевых сигнальных путей. Все это позволяет предположить существование механизмов, с помощью которых препараты на основе фосфорилированных полипренолов могут подавлять размножение безоболочечных вирусов, как показано в отношении парвовирусов, аденовирусов и пикорнавирусов. Так, препятствуя синтезу холестерина [10] и конкурентно вытесняя его из липидных рафтов, Фоспренил и Гамапрен^®  могут предотвращать проникновение упомянутых агентов в клетки-мишени. Любопытно, что выраженным антивирусным действием в отношении калицивирусов, включая калицивирус кошек, обладают растительные флавоноиды [24, 28], для которых характерны такие же зависимые от концентрации изменения антиоксидантных и прооксидантных свойств, как у фосфорилированных полипренолов [14, 29].

Помимо прямого противовирусного воздействия Фоспренил и Гамапрен^®  стимулируют противовирусный иммунный ответ. Например, после введения в организм при вирусной инфекции они индуцируют раннее образование ИФН-γ, ФНОα и ИЛ-6 и ИЛ-12 [4, 22], а также стимулируют активность естественных киллерных клеток [3], что, по-видимому, является одним из ключевых механизмов противовирусной активности Гамапрена^®   при его использовании на ранних стадиях инфекционного процесса. Кроме того, судя по быстрому восстановлению уровня глобулиновой фракции под действием Гамапрена^®, стимулируется и функция гуморального звена иммунитета. Это подтверждается ранее полученными данными о наличии у фосфорилированных полипренолов адъювантных свойств, в том числе по отношению к безоболочечному человеческому энтеровирусу [6].

Вирусы способны нарушать сбалансированное развитие Th1/Th2 иммунного ответа, необходимое для формирования эффективного противовирусного иммунитета, а Гамапрен^®, судя по всему, может восстанавливать этот необходимый баланс, в частности посредством стимуляции продукции ключевых цитокинов. Это свойство Гамапрена^®  в сочетании с прямым противовирусным действием, по-видимому, и обеспечивает защиту животных от вирусных инфекций.

Одним из немногих противовирусных препаратов, разрешенных в США для лечения инфекционных болезней кошек, является Полипрениловый иммуностимулятор (PI), основным действующим веществом которого также являются фосфорилированные полипренолы, выделенные из листьев шелковицы. Этот препарат и Гамапрен^®   первоначально предназначались для лечения герпесвирусных инфекций кошек [18], но они также проявили эффективность при сухой форме инфекционного перитонита кошек [9, 16, 19].

Заключение. На основании результатов проведенного исследования можно констатировать, что включение Гамапрена^®  в схему лечения кошек при калицивирозе  сокращает сроки клинического выздоровления и восстанавливает структурные и биохимические показатели крови. Гамапрен^®   одинаково эффективен, как при подкожном, так и при пероральном введении.

Литература

1. Глотова Т.И., Сильников В.Н., Королева Л.С. и др. Противовирусная активность нового химического соединения. РВЖ СХЖ. 2012; 1:22 – 24.

2. Глотова Т.И., Глотов А.Г., Русских В.В., Тугунова Т.Б. Противовирусная активность нового средства гамапрен в отношении вируса ринотрахеита кошек. Ветеринария. 2008; 10:63 – 68.

3. Григорьева Е.А., Пронин А.В., Санин А.В. и др. Воздействие препарата Гамавит на активность естественных киллерных клеток. Ветеринария Кубани. 2016;   4:27, 28.

4.Кожевникова Т.Н., Ожерелков С.В., Изместьева А.В. и др. Влияние препаратов гамапрен и фоспренил, созданных на основе полипренолов растительного происхождения, на продукцию некоторых регуляторных цитокинов в норме и при экспериментальном клещевом энцефалите у мышей. Российский иммунологический журнал. 2008; 11(2 – 3):250.

5. Кожевникова Т.Н., Викторова Е.Г., Козлов В.Г. и др. Морапренилфосфаты подавляют размножение вируса энцефаломиелита Тейлера и накопление вирусного белка VP3 в чувствительных культурах клеток BHK-21 и P388D1. Микробиология. 2007; 3:26 – 30.

6. Кожевникова Т.Н , Ворович М.Ф., Козлов В.Г. и др. Использование фоспренила в качестве адъюванта для вакцин и стимулятора продукции специфических антител при изготовлении гипериммунных сывороток. РВЖ МДЖ. 2006;  2:8 – 10.

7. Наровлянский А.Н., Дерябин П.Г., Седов А.М. и др. Противовирусная активность полипренилфосфатов при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом гепатита С in vitro. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2012;  5:80 – 84.

8. Ожерелков С.В., Кожевникова Т.Н., Наровлянский А.Н. и др. Противовирусное действие препаратов Фоспренил и Гамапрен в отношении флавивирусов. Ветеринария и кормление. 2017; 3:78 – 80.

9. Переслегина И.О., Виденина А.А., Наровлянский А.Н. и др. Новое в лечении кошачьего инфекционного перитонита. РВЖ  МДЖ. 2013; 1:6 – 10. 10. Руднева С.Ю., Наровлянский А.Н., Пронин А.В. и др. Лечение папилломатоза ротовой полости у собаки с использованием фоспренила. РВЖ МДЖ. 2016; 3:9 – 11.

11. Савойская С.Л., Клицунова Н.В., Наровлянский А.Н. и др. Эффективность препарата Гамапрен при лечении аденовироза и парагриппа собак. Ветеринарный доктор. 2008;  10:15, 16.

12. Санин А.В., Савойская С.Л., Васильев И.К. и др. Применение Гамапрена при лечении вирусных инфекций у кошек. Ветеринария Кубани. 2009;  6:29, 30.

13. Санин А.В., Суханова С.А., Проскурина О.В. и др. Исследование противовоспалительной активности фоспренила в эксперименте. РВЖ МДЖ. 2011;  4:17 – 20.

14. Санин, А.В., Наровлянский А.Н., Пронин А.В. и др. Изучение антиоксидантных свойств Фоспренила в различных биологических тест-системах.  Российский ветеринарный журнал. 2017; 10:38 – 41.

15. Санин А.В., Суслов А.П., Третьяков О.Ю. и др. Разнонаправленное влияние MIF и полипренилфосфата на течение экспериментальнойфлавивирусной инфекции у мышей. Микробиология. 2011;  5:56 – 61.

16. Фурман И.М., Васильев И.К., Наровлянский А.Н. и др. Применение препаратов на основе растительных полипренолов при различных формах кошачьего инфекционного перитонита. РВЖ МДЖ. 2010;  3:42, 43.

17. Gaskell R.M., Dawson S., Radford A.D. Feline respiratory diseases. In: Greene C. (Ed.). Infectious diseases of the dog and cat. 4th ed. St Louis: Elsevier Saunders. 2012; 151 – 162.

18. Legendre A.M., Kuritz T., Heidel R.E., Baylor V.M. Polyprenyl Immunostimulant in Feline Rhinotracheitis: Randomized Placebo-Controlled Experimental and Field Safety Studies. Front. Vet Sci. 2017. 27 February. https://doi.org/10.3389/fvets.2017.000024.

19. Legendre A.M., Kuritz T., Galyon G. et al. Polyprenyl Immunostimulant Treatment of Cats with Presumptive Non-Effusive Feline Infectious Peritonitis In a Field Study. Front Vet. Sci. 2017; Feb 14: 4 – 7. https://doi.org/10.3389/fvets....

20. Pesavento P.A., Chang K., Parker J.S.L. Molecular virology of feline calicivirus. Vet. Clin. North Am Small Anim. Pract. 2008;  38:775 – 786.

 21. Pronin A.V., Danilov L.L., Narovlyansky A.N. et al. Plant Polyisoprenoids and Control of Cholesterol Level. Arch. Immunol.Therap Exper. 2014;  62(1):31 – 39.

22. Pronin A.V., Grigorieva E.A., Sanin A.V. et al. Polyprenols as Possible Factors that Determine the Instructive Role of Innate Immunity in the Acquired Immune Response. Russian J. Immunol. 2002;  7(2):135 – 142.

23. Radford A, Coyne K., Dawson S. et al. Feline calicivirus. Vet. Res. 2007;  38 (2):319 – 335.

24. Seo D.J., Jeon S.B., Oh H.L. et al. Comparison of the antiviral activity of flavonoids against murine norovirus and feline calicivirus. Food Control.  2015; 60:25 – 30.

25. Simons K., Ehehalt R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 2002; 110(5):597 – 603.

26. Stuart A.D., Eustace H.E., McKee T. A., Brown T.D. A novel cell entry pathway for a DAF-using human enterovirus is dependent on lipid rafts. J. Virol. 2002; 76: 9307 – 9322.

27. Stuart A.D., Brown T.K. Entry of Feline Calicivirus Is Dependent on Clathrin-Mediated Endocytosis and Acidification in Endosomes. J. Virol. 2006;  80(15):7500 – 7509.

28. Su X., D’Souza D. H. Naturally Occurring Flavonoids Against Human Norovirus Surrogates. Food and Environmental Virology. 2013;  5(2): 97 – 102.

29. Sugihara N., Arakawa T., Ohnishi M., Furuno K. Anti- and pro-oxidative effects of flavonoids on metal-induced lipid hydroperoxide-dependent lipid peroxidation in cultured hepatocytes loaded with alpha-linolenic acid. Free Radic. Biol. Med. 1999;  27(11 – 12):1313 – 1323.

30. Triantafilou K., Triantafilou M. Lipid-raft-dependent Coxsackievirus B4 internalization and rapid targeting to the Golgi. Virology. 2004;  326:6 – 19.

Опубликовано:Журнал Ветеринария №5